• Перистальтичний насос
  • Створення градієнта концентрації CsCI


  • Дата конвертації16.04.2017
    Розмір17.29 Kb.
    Типреферат

    Скачати 17.29 Kb.

    Техніка рідинної, колонкової хроматографії

    Реферат на тему:

    Техніка рідинної, колонкової хроматографії

    2009

    Конструкції хроматографических колонок і апаратура для рідинної хроматографії низького тиску

    Хроматографічні колонки низького тиску

    конструкція колонок

    Під низьким тиском мається на увазі, що тиск, що забезпечує протікання робочої рідини через колонку не перевищує 4-х атмосфер.

    Зліва зображена колонка для препаратівного варіанти хроматографії. Такі колонки готуються зі звичайного молібденового скла товщиною близько 1 мм. Вони можуть досягати 8 см в діаметрі і 1,5 м у висоту. Зверху колонка забезпечена стандартним шліфом (№ 29), куди вставляється шліфована пробка з крапельницею. Після заповнення колонки робочим складом пробку встановлюють на місце, змастивши попередньо верхню половину її шлифа силіконовою змазкою, але так, щоб вона не потрапила всередину колонки. Потім, злегка притискаючи, пробку повертають. Якщо шліф добре притертими, шар мастила повинен стати прозорим. Герметичність посадки пробки слід перевіряти перед кожним досвідом. При непрацюючому насосі (він подає рідину зверху) і звільненому затиску, що стоїть на гумовій трубці виходу з колонки, рідина з неї випливати не повинна. До речі, установка скляного крана замість простого затиску на виході з колонки недоцільна через небезпеку потрапляння мастила крана в канал рідини. У нижню частину колонки заплавлені скляний фільтр, виготовлений спеканием скляного порошку.

    На рис. 1 справа зображена аналітична колонка малого діаметра (-5 мм) з напаяв на неї сорочкою для протікання термостатирует колонку води. Пробка-шліф (№ 14), скляний фільтр і затискач на виході колонки такі ж, як у препаратівного варіанту.

    Цілий ряд фірм випускають готові колонки низького тиску - як правило, розбірні. Ущільнення на обох кінцях в них здійснюється за допомогою гумових прокладок.

    робочі гранули

    Вміст хроматографических колонок будь-якого типу завжди представлено якимись сферичними «гранулами» малого розміру (20-30), виготовленими з пористого матеріалу, щільно і рівномірно упакованими (в оточенні рідини) по всьому об'єму колонки. Хімічний склад гранул і навколишнього робочої рідини визначають тип хроматографії. Далі ми розглянемо найважливіші з цих типів докладно. Зараз же, щоб до цього більш не повертатися, торкнемося деяких моментів, пов'язаних з підготовкою колонок низького тиску для будь-якого типу хроматографії в лабораторних умовах.

    По-перше, самі гранули, якщо вони поставляються в сухому вигляді, необхідно перед вживанням промити, дати їм набрякнути, а потім звільнити від дрібних уламків і пилу, які, внаслідок стирання при транспортуванні, неминуче засмічують фірмові препарати. Цей «сміття» забивається в простору між гранулами в колонці і заважає вільному протіканню робочої рідини. Видалення дрібних частинок здійснюють за допомогою операції «відмулювання». Розбавлену суспензію набряклих, промитих і переведених в потрібний буфер гранул заливають доверху в мірний циліндр, обсяг якого в 5-6 разів більше, ніж обсяг осіли вологих гранул. Вони збираються протягом кількох хвилин у нижній частині циліндра. Як тільки між осілими гранулами і каламутній рідиною над ними позначається різка межа, цю рідину відсмоктують і викидають. Знову заповнюють циліндр робочої рідиною, обережно скляною паличкою взмучивают осад по всьому об'єму циліндра і дають йому осісти, потім знову відсмоктують над облог очну рідину. Цю операцію повторюю 3-4 рази до тих пір, поки рідина над щойно осілими гранулами не опиниться зовсім прозорою. Потім вичікують ще кілька хвилин (до повного осідання шару гранул), вимірюють його висоту і відсмоктують рідину на цей раз до такого рівня, щоб висота шару рідини становила половину висоти осаду. Таке співвідношення при взмучиванії всього вмісту дозволяє отримати «кашку», консистенція якої найбільш зручна для заливки в колонку.

    Підготовка та заповнення колонки

    Добре промиту колонку занурюють нижнім кінцем в стакан з буфером або інший робочої рідиною, а в гніздо верхнього шлифа вставляють пробку з трубкою, яку приєднують до Водоструминні насоси. Після чого на короткий час відпускають затискач на вихідний гумовій трубці. Рідина зі склянки енергійно всмоктується в колонку знизу через скляний фільтр (рис. 1а), чим досягається повне видалення повітря з фільтра.

    Тепер можна пробку вийняти і надлишку рідину виллє, щоб над фільтром залишився шар, висота якого приблизно дорівнює діаметру колонки. Злив закрити. У гніздо верхнього шлифа вставити подовжувальну трубку такого ж діаметру, як колонка, зі шліфом на нижньому кінці і вдвічі коротше, ніж сама колонка. У подовжувальну трубку вставляють лійку. Кашку гранул обережно збовтують і відбирають в мірний

    Мал. 1

    стакан обсяг, який дорівнював півтора обсягами передбачуваної робочої частини колонки. Колонку разом з подовжувальною трубкою злегка нахиляють і, ще раз збовтавши кашку в склянці, виливають відразу весь його вміст в воронку (рис. 1б). Кашка стікає по стінці колонки. У разі утворення бульбашки повітря, він легко підніметься і вийде через не надто густий шар поточної суміші.

    Після цього колонку встановлюють вертикально, на місце воронки в подовжувальну трубку вставляють гумову пробку з трубочкою, приєднаної до перистальтичних насосів. Звільняють зажим на виході з колонки і включають насос на ту швидкість, з якою передбачається вести робоче фракціонування в колонці. Шар гранул поступово ущільнюється до свого «робочого об'єму». Після цього можна від'єднати насос, дати можливість всій рідини з подовжувальної трубки увійти в колонку. Зняти подовжувальну трубку, встановити на місце верхню шлифованную пробку, під'єднати її знову до насоса і прокачати колонку 2-3 години вхолосту для остаточної «укладання» гранул в колонці. Після чого можна приступати до її завантаженні препаратом і фракціонування.

    Коротку колонку (менше 20 см) можна наповнити гранулами на 3/4 її висоти і без допомоги подовжувальної трубки. Приготувати кілька більш густу кашку гранул (1,15: 1), залити її прямо в колоночку і відразу почати прокачування робочої рідини зі швидкістю, наміченої для проведення експерименту, протягом години. За цей час гранули осядуть до свого робочого рівня.

    Резервуари для елюента

    Якщо немає можливості скористатися насосом (і гранули в колонці не надто дрібні - рідина може протікати через неї «самопливом») то для підтримки постійної швидкості течії рідини через колонку можна скористатися простим пристроєм, що має назву «колбою Маріотта». Пробка, через яку проходять дві трубочки повинна щільно закривати колбу з робочою рідиною ( «елюентом»). У цьому випадку швидкість витікання елюента з колби не змінюватиметься, - незважаючи на зниження рівня рідини в ній, - до тих пір, поки цей рівень не опуститься до нижнього кінця допоміжної трубочки, по якій повітря потрапляє в простір над рівнем рідини в колбі . Справа в тому, що аж до цього моменту сума тисків повітря під пробкою і стовпа рідини над нижнім кінцем допоміжної трубочки залишається незмінною - рівний атмосферному тиску. Відрегулювати швидкість протікання рідини через колонку можна становищем кінця петлі, приєднаної до її виходу, як це показано на рис. 2 б.

    Мал. 2

    Швидкість протікання рідини через колонку ( «швидкість елюції») буде визначатися гідравлічним напором - різницею рівнів «Н».

    Як буде видно з подальшого, при хроматографическом поділі речовин в більшості випадків використовують градиентную елюція колонок з лінійним (або нелінійним) зміною змісту активного компонента в елюіруются рідини. Ці градієнти утворюються точно таким же чином (комбінацією змішувач - резервуар), як це було описано для створення градієнта концентрації сахарози при ультрацентріфугірованіі.

    д) Внесення препарату на колонку

    Вихідний препарат в більшості випадків вносять в хрому-графічною колонку розчиненим в тому ж буфері, яким «врівноважена» сама колонка. Треба простежити за тим, щоб розчин препарату був прозорий, вільний від часток або пилу. При необхідності його слід «освітлити» центрифугуванням або відфільтрувати.

    У відкриту колонку препарат вносять вручну, з піпетки. Починають з того, що спускають рідину з колонки так, щоб відкрився, але не почав обсихати верхній шар гранул. Зливну трубку затискають. Розчин препарату обережно, щоб не скаламутити гранули, заливають з піпетки по стінці колонки, починаючи від відстані в 1 мм над поверхнею гранул і поступово, разом з рівнем препарату, просуваючи кінчик піпетки вгору по стінці. Після того, як весь обсяг препарату внесений в колонку, зливну трубочку звільняють від затискання і дають шару препарату увійти повністю в верхній шар гранул. Таким же чином вносять обсяг елюента, що дорівнює об'єму препарату, а потім запускають і його в гранули. Таку промивання стінок колонки доцільно повторити ще раз. Нарешті заливають ще елюент на висоту 1-2 см і вставляють верхню пробку з крапельницею. Шар вільного елюента над гранулами потрібен для того, щоб запобігти оголення верхньої поверхні шару гранул при непрацюючому насосі і відкритому зливі з колонки. (В перший момент після відкриття зливу деяка кількість рідини має вилитися, щоб під верхнім ковпачком колонки утворилося розрідження, що припиняє подальший злив рідини.)

    Разом з тим, слід мати на увазі, що в разі градиентной елюції у вільному шарі елюента над гранулами відбувається перемішування градієнта. Тому в цьому випадку висота вільного шару рідини над гранулами повинна бути мінімально необхідною. Після того, як внесення препарату і підготовка колонки закінчені, можна почати процес елюції, відкривши зливну трубку і включивши насос.

    У фірмових колонок всі описані операції спрощуються завдяки наявності спеціального «адаптера». Спосіб його використання наводиться в технічному описі колонки.

    Варто згадати ще про одну «дрібниці». Вкрай небажано попадання в будь-яку ділянку рідинного тракту, обслуговуючого хроматографическую колонку, бульбашок повітря. Тому з'єднання будь-яких двох поліетиленових трубочок цього тракту (зазвичай через перехідник із силіконової гуми) слід проводити так, щоб перехідник на нижній трубочці був заповнений з виступаючим меніском, а на кінці верхньої трубочки висіла крапелька (або навіть текла рідина). Капелька зливається з меніском і в цьому вільному від повітря «оточенні» верхня трубочка вставляється в перехідник.

    Перистальтичний насос

    Перистальтичні насоси можуть створювати тиск на вході в колонку до 5 атмосфер і в дуже широкому діапазоні варіювати швидкість подачі рідини: від сотих часток мілілітра до тисяч мілілітрів на годину. Головна їхня відмінність ще в тому, що нагнітається рідина в насосі не контактує ні з чим, окрім трубочки з силіконової гуми, всередині якої вона перебуває. Крім того перистальтичні насоси забезпечують мінімум пульсації і можливість плавного регулювання швидкості подачі рідини. На рис. 3а зображена схема робочої частини перистальтичного насоса роликового типу.

    Мал. 3

    6 роликів вільно сидять на своїх осях розташовані по периферії плоского, диска, що обертається. Регульована гвинтом пластинка в будь-який момент часу притискає вельми еластичну гумову трубку до трьох нижнім роликам так, що рідина всередині трубки видавлюється з-під роликів і збирається в двох здутті між ними. Ролики прокочуються по трубці. В наступний момент часу правий ролик відійде вгору і звільнить вихід рідини з правого здуття назовні, до колонки. Цю рідину буде видавлювати середній ролик, що котиться вправо. Лівий ролик, рухаючись за середнім буде переміщати ліве здуття вправо, у напрямку до виходу. Тим часом в ліве положення буде підходити зверху наступний ролик. Він замкне нове здуття, відновлюючи зображену на малюнку картину.

    Завдяки гвинта регулювальну пластину можна відсунути від роликів так, щоб вона забезпечувала перетискання змінною, більш товстої гумової трубки. Так здійснюється перехід на новий діапазон великих швидкостей подачі рідини.

    Легко уявити собі не показаний на малюнку електромотор, що обертає ведучий диск. Зазвичай використовують так звані «крокові» електромотори. Їх обертання визначається тривалістю і частотою проходження електричних імпульсів, що виробляються вбудованим в насос електронним генератором імпульсів. Такі насоси відрізняються дуже тонкої регулюванням і постійністю швидкості обертання.

    Роликові насоси будь-якої конструкції мають один спільний недолік - їх ролики злегка прослизають по гумовій трубці і поступово її зношують.

    На рис. 3 показана схема робочої частини перистальтичного насоса планетарного типу. Те, що принцип його роботи такий же, як описано вище, кидається в очі відразу. Відмінність полягає в тому, що периферійні, робочі ролики (які навіть не мають осей) обертаються навколо одного центрального ролика, пов'язаного з електромотором.

    Цей ролик силою тертя змушує обертатися все периферійні ролики так, що вони без всякого ковзання котяться по гумовій трубці. (Ступінь їх притиснення до гумі і тут регулюється гвинтом.) Однак в цій системі тривала експлуатація приладу теж призводить до зносу. Але не гуми, а самих роликів, що виготовляються з тефлону. Що порушує їх зчеплення з центральним роликом.

    Створення градієнта концентрації CsCI

    Зазначена раніше мала в'язкість сольових розчинів має ту зворотний бік, що вона не дозволяє заздалегідь (як це роблять для розчинів сахарози) створювати в центрифужной пробірці градієнт концентрації солі. Цей градієнт дуже швидко буде зруйнований за рахунок дифузії іонів солі. Зате, зважаючи на тяжкість молекули CsCI, при тривалому і постійному по швидкості обертання спочатку однорідного розчину солі встановлюється динамічна рівновага між седиментацією самих молекул солі і їх дифузією. В результаті утворюється (в ході самого центрифугування!) Якийсь, нелінійний градієнт концентрації CsCI, a отже, і щільності його розчину по висоті пробірки. Цілком придатний для фракціонування біологічних макромолекул або частинок по їх плавучої щільності.

    Встановлення градієнта щільності розчину CsCI в ході центрифугування - процес довгий. Він займає, як мінімум, 60-70 годин. Його можна дещо прискорити, якщо попередньо заповнити пробірку трьома рівними порціями розчинів CsCI різної щільності: середньої для середнього шару заповненої пробірки і, відповідно, збільшеної або зменшеної на половину від величини відмінності щільності, які очікують отримати для рідкого середовища центрифугування у дна пробірки і на її меніску.

    З цією ж метою рівноважний ультрацентрифугирование проводять іноді в кутових роторах. Розподіл щільності розчину CsCI під час центрифугування йде все одно в напрямку радіуса обертання, але значно швидше, оскільки в цьому напрямку похило стоїть пробірка набагато коротше (див. Рис. 48а). На тому ж малюнку умовно-дискретними зонами показано розташування шарів різної щільності CsCI до кінця центрифугування (різна штрихування) і знаходяться

    Мал. 48

    між ними смуги розділилися частинок (жирними лініями на рис. 486). Положення цих зон і смуг в пробірці, витягнутої з ротора після закінчення центрифугування показано на рис. 48 в. Протягом деякого часу, поки дифузія НЕ розмиє цю картину, роздільне положення смуг речовини зберігається.

    Як приклад приведу результат очищення рівноважним центрифугуванням плазмід від домішки основної маси ДНК бактерії (Currier, Nester, 1976). Основну масу ДНК бактерії - господаря видаляли денатурацією при рН12,2 і переведенням її в фенольну інтерфазу в присутності 0,5 М NaCI (див. Гл. 3, § 2). Плазмідна ДНК залишалася в водної фазі, де вона легко ренатуріруется. Подальшу її очищення вели рівноважним центрифугуванням в CsCI з додаванням бромистого етидія для забарвлення смуг. Використовували 48% -ний розчин CsCI, чому відповідала його початкова щільність 1,55 г / см 3. (Така мала значення цієї щільності обумовлено зменшенням плавучої щільності ДНК обох типів за рахунок зв'язку з барвником.) Центрифуговані при температурі 14 ° С в кутовому роторі (Spinco-40) при 35 000 об / хв протягом 60 годин. На графіку рис. 49 показано надійне відділення ДНК плазмід (пік 1) від залишків основної ДНК бактерії (пік 2).

    література

    Музя Г.І., Куликов В.І., Ванько Л.В., Сухих Г.Т. Роль фосфолипидного фактора активації тромбоцитів в репродукції // Акушерство і гінекологія -1996. -3. -С.12-16.

    2. Музя Г.І., Орлов С.М., Бердишев Є.В., Куликов В.І. Взаємодія 1-О-алкіл-2-метокси-sn-гліцеро-3-фосфохоліна і фактора активації тромбоцитів з клітинами крові і пухлинними клітинами // Біохімія.-1994.-Т. 56.-С.-1054-1061.

    3. Мисляева Т.Г. Динаміка електролітів в процесі зневоднення організму. Всесоюзна конференція. - Ленінград.1978.